В течение 40 лет исследователи полагались на кровь мечехвостов для выявления эндотоксинов в лекарственных препаратах. Теперь синтетические альтернативы и обновлённые нормативные акты могут положить конец этой практике.
Каждый год в мае, когда прилив совпадает с полнолунием, мечехвосты (или подковообразные крабы) собираются на пляжах среднеатлантического побережья, чтобы отложить миллионы яиц. В это же время перелётные береговые
птицы, летящие на север, делают остановку, чтобы полакомиться этими яйцами.
Эта, казалось бы, точно рассчитанная по времени серия событий происходит уже более десяти тысяч лет, но в последние несколько десятилетий она была прервана фармацевтической промышленностью, которая нуждается в крови мечехвостов.
Промышленность использует эту кровь для тестирования безопасности лекарственных препаратов перед их распространением среди людей. Фармацевтические компании ежегодно собирают более миллиона мечехвостов для этих целей.
Если бы мечехвосты внезапно исчезли, доступность лекарств оказалась бы под угрозой. «С точки зрения цепочки поставок лекарств, это довольно безумно, что мы поставили себя в такую рискованную ситуацию», - говорит Тим Чернак, химик из Мичиганского университета. «Может случиться пандемия, и мы не сможем развернуть вакцинацию, если это животное просто перестанет существовать».
Чтобы защитить эту хрупкую экосистему и управлять рисками в цепочке поставок лекарств, учёные за последние четыре десятилетия создали синтетические альтернативы крови подковообразных крабов для тестирования безопасности лекарств. Внедрение этих методов идёт медленно, но исследователи в области экологии надеются, что недавние изменения в правилах тестирования сделают отрасль менее зависимой от этих древних существ.
Научные основы тестирования на эндотоксины
Производители лекарств должны тестировать на эндотоксины все инъекционные препараты и медицинские устройства, включая вакцины, клеточные и генные терапии, а также продукты для диализа.
Эндотоксин - это естественный компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, который обеспечивает бактериям структурную и защитную функцию.
Когда фармацевтические компании используют эти бактерии для производства рекомбинантных белковых и нуклеиновых кислотных препаратов, бактерии могут выделять эндотоксины в процессе своего роста и гибели. Основным эндотоксином, вызывающим озабоченность в фармацевтической промышленности, являются липополисахариды (LPS), и большинство тестов на эндотоксины предназначены для обнаружения LPS.
«Эндотоксин, попадая в наш кровоток, вызывает множество иммунных реакций», - говорит Джек Линг Дин, молекулярный иммунолог и почётный профессор Национального университета Сингапура. Эндотоксины могут вызывать воспаление, септический шок и, если их не контролировать, смерть.
Фото: the-scientist.com
В 1956 году медицинские исследователи Фредерик Банг и Джек Левин обнаружили, что кровь мечехвоста свёртывается при контакте с эндотоксинами. Этот механизм свертывания защищает его, удерживая проникшие микробы и их токсины, предотвращая их распространение по кровеносной системе подковообразного краба.
Через два десятилетия после этого открытия Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило лизат амебоцитов Limulus (LAL) - водный экстракт крови мечехвостов, содержащий свёртывающие белки - для тестирования на эндотоксины. Это заменило привлечение кроликов, которые использовались для тестирования на эндотоксины с 1940-х годов.
Тест LAL работает следующим образом: если лекарство загрязнено эндотоксином, оно активирует фермент Limulus -свёртывающий фактор C, который затем запускает цепь реакций, приводящих к образованию нерастворимого геля. Это является основой гелевого теста LAL, но два других метода LAL основаны либо на изменении цвета, либо на флуоресценции.
На пути к синтетическим альтернативам для тестирования на эндотоксины
Разработка синтетических альтернатив для тестирования на эндотоксины началась в 1980-х годах, когда эмбрионы в рамках национальной программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в Сингапуре начали преждевременно погибать. Подозреваемым виновником был эндотоксин.
Боу Хо, микробиолог из Национального университета Сингапура, муж Дин и соавтор многих проектов, использовал тесты LAL для подтверждения того, были ли эмбрионы заражены бактериями. Но из-за ограниченного финансирования исследований стоимость набора LAL была финансово непосильной.
Они рассмотрели возможность использования подковообразных крабов, обитающих в Сингапуре, но и это было проблематично. «Мы не могли получить достаточно крови, не уничтожив этот вид», - говорит Дин. Вместо этого она и Хо решили разработать синтетическую альтернативу крови подковообразных крабов. «Мы решили, что должны клонировать ген фактора C».
Фото: the-scientist.com
Впервые она клонировала фактор C в 1995 году, а в 2001 году разработала флуоресцентный тест, основанный только на рекомбинантном факторе C (rFC) для обнаружения эндотоксинов. В её тесте, когда эндотоксин из грамотрицательных бактерий активировал rFC, он гидролизовал флуорогенный субстрат.
Учёные обнаружили, что rFC производил более низкую фоновую флуоресценцию и был более чувствительным, чем коммерческий тест LAL, существовавший в то время. Компания Lonza лицензировала и коммерциализировала тест в 2003 году.
Только в 2018 году FDA одобрило первый препарат, в котором использовался rFC для тестирования на эндотоксины - Emgalit (галканезумаб) компании «Eli Lilly and Company».
«Были долгие споры по поводу данных и их сопоставимости с LAL», - говорит Джей Болден, старший директор отдела аналитических услуг и контроля качества компании Eli Lilly. «При этом упускался из виду тот факт, что это продукт биотехнологии. Это точно такой же белок, как и в подковообразном крабе».
Eli Lilly начала использовать rFC в 2013 году, когда компания собирала большое количество данных о синтетической альтернативе: насколько хорошо она работает, насколько результаты сопоставимы с LAL и соответствует ли она международным стандартам, установленным Международным советом по гармонизации технических требований к лекарственным средствам для медицинского применения.
Болден, который возглавлял эти исследования, сказал, что данные «выглядели действительно хорошо». В другом анализе Болден собрал более 1000 данных, сравнивающих LAL с rFC из литературы, и обнаружил, что rFC снова сопоставим с LAL. Другие исследования также показали, что тестирование эндотоксинов с помощью rFC эквивалентно LAL.
«Он стоит на одном уровне с LAL», - говорит Дин. «Больше нет причин производить LAL, который имеет некоторые вариации чувствительности при обнаружении».
Использование очищенных рекомбинантных белков также может быть более стандартизированным по сравнению с кровью, состав которой может меняться в зависимости от здоровья подковообразного краба, условий его жизни и возраста. «Этот вид рекомбинантного реагента - прекрасный пример того, что может снизить нагрузку на многие системы», - говорит Чернак.
Фото: the-scientist.com
С тех пор многие другие фармацевтические компании производят свои собственные синтетические альтернативы для тестирования эндотоксинов на основе rFC или всей каскадной системы свёртывания крови мечехвостов, называемой рекомбинантным каскадным реагентом. Однако, несмотря на эти усилия, производители лекарств по-прежнему не решаются отказаться от крови подковообразных крабов.
Пересмотренные рекомендации спустя десятилетия
Из 50 крупнейших фармацевтических компаний мира только 10–15 начали использовать синтетические альтернативы для тестирования на эндотоксины, по словам Элизабет Беннетт, директора по коммуникациям «Revive and Restore», природоохранной организации, которая применяет биотехнологии для выживания исчезающих видов.
«В целом, подавляющее большинство фармацевтических компаний по-прежнему используют LAL», - говорит Беннетт. Одним из препятствий для внедрения, которое она упомянула, являются нормативные рекомендации.
Американская фармакопея (USP), независимая некоммерческая организация, которая публикует руководящие принципы по качеству для медицинской промышленности, устанавливает принципы по тестированию на эндотоксины для Соединённых Штатов. В прошлом USP включала руководящие принципы по тесту LAL, но не по синтетическим альтернативам. Несмотря на независимость от FDA, стандарты, установленные USP, часто используются регулирующими органами.
«Я рассматриваю это как книгу рецептов», - говорит Чернак. Он упомянул, что «рецепты» в USP - это то, что FDA ожидает увидеть в заявке на регистрацию лекарственного препарата. Для фармацевтических компаний использование этих предписанных рецептов гарантирует беспроблемную подачу заявки.
«Здесь на карту поставлена судьба продукта, стоимость которого исчисляется миллиардами долларов. Фармацевтическая компания не может позволить себе допустить ошибку при подаче заявки в FDA», - говорит Чернак. «Отсутствие главы USP о синтетических альтернативах значительно замедлило переход».
Беннетт убедилась в этом на собственном опыте, когда спросила фармацевтические компании, почему они не перешли на новый метод. Ответ, который она получала, всегда был одним и тем же: «Регуляторные нормы не позволяют мне этого сделать», - слышала она каждый раз.
Работа по обновлению рекомендаций USP по тестированию на эндотоксины началась в 2019 году, но эти ранние попытки не увенчались успехом по разным причинам - внутренней политике, заинтересованности поставщиков LAL в продолжении производства LAL и сохраняющимся сомнениям по поводу альтернатив.
Только в мае 2025 года USP добавила новую главу о синтетических альтернативах LAL. Болден, которая входила в состав Экспертного комитета USP по микробиологии, помогала разрабатывать эту новую главу, начиная с 2023 года.
Главы USP проходят проверку на уровне подкомитета - например, подкомитета по эндотоксинам - полного экспертного комитета, а также заинтересованных сторон, включая консультантов, представителей фармацевтических компаний, FDA и представителей USP, прежде чем они будут утверждены.
Хотя в руководящих принципах USP не содержится требования о замене теста LAL на rFC, это значительный шаг вперёд в признании rFC в качестве эквивалентного теста.
Празднование устойчивого развития
«Revive and Restore» недавно запустила систему оценки устойчивости для тестирования эндотоксинов, которая отслеживает внедрение фармацевтическими компаниями устойчивых альтернатив LAL.
Эти оценочные листы - то, что Беннетт назвала «первым публичным показателем, который измеряет прогресс фармацевтической промышленности в области устойчивого тестирования эндотоксинов. Это инструмент подотчётности. Мы любим говорить, что это игровая версия экологического управления, которую мы хотели бы видеть в отрасли».
«Revive and Restore» сотрудничала с различными фармацевтическими компаниями для разработки оценочных таблиц, которые измеряют общественное признание замены LAL, сокращение использования LAL и то, приняли ли фармацевтические компании синтетические альтернативы для новых или старых продуктов.
«Нам нужно определить, что на самом деле является правильным для фармацевтической отрасли, помимо этической и экологической точек зрения», - говорит Беннетт. Она считает, что лучшие результаты для этих компаний, вероятно, будут связаны с улучшением их цепочек поставок и оптимизацией процессов и бизнес-операций.
Фото: the-scientist.com
«rFC принесла нам пользу с точки зрения качества. Это обеспечило безопасность нашей цепочки поставок. Очевидно, что это лучше с точки зрения биоразнообразия и этики, а для нас, честно говоря, это было экономически выгодно», - говорит Беннетт. «Мы действительно хотели, чтобы это стало для фармацевтических компаний возможностью получить признание за то, что они делают, потому что как часто крупные фармацевтические компании отмечаются в популярной культуре? Нечасто».
«Это самое древнее существо на нашей планете. Оно пережило пять массовых вымираний. Оно живет на планете уже 450 миллионов лет», - говорит Чернак. «У нас нет причин продолжать добывать это животное».